Denis Dufour commence ses études musicales au Conservatoire National de Région (CNR) de Lyon en 1972, puis étudie au CNSM de Paris avec Michel Philippot et Ivo Malec (composition instrumentale), Claude Ballif (analyse), Guy Reibel et Pierre Schaeffer (composition électroacoustique) de 1974 à 1979. Chercheur et membre de l’INA-GRM dès 1976, il enseigne comme assistant dans la classe d’électroacoustique du CNSM de Paris, puis il fonde en 1977 l’Ensemble TM+, pour lequel il a suscité la création d’un important corpus d’œuvres mixtes et « live electronic ». Il assiste en studio Pierre Schaeffer, Marcel Landowski, Guy Reibel et François Bayle, et participe à l’élaboration de l’Acousmographe, à la préparation de séminaires… Il intervient aussi dans l’élaboration du système SYTER pour lequel il compose la première œuvre pour instruments et transformation numérique en temps réel Ourlé du lac (1984) jouée lors de l’ICMC 1984 organisée à Paris par l’Ircam.

En 1980, il crée au CNR de Lyon une classe de composition acousmatique et instrumentale dont il est le professeur titulaire jusqu’en 1995. Il crée les concerts Acore en 1982, organisant un cycle régulier de manifestations chaque année. Cofondateur en 1984 du collectif de compositeurs Quark, il accueille, de 1989 à 1994, les Rencontres de Crest sur l’Art acousmatique. En 1993, il crée le festival Futura (festival international d’art acousmatique et des arts de support) à Crest (Drôme). En 1997 il lance Motus, structure d’organisation de concerts et d’événements (Odysson, Acousma-rave, etc.), de gestion du plus important dispositif privé de projection du son, et de réalisation d’un label discographique dédié à la musique contemporaine (acousmatique et instrumentale). En 2004,  il fonde l’ensemble Syntax formé avec cinq enseignants du CNR Perpignan-Méditerranée et qui compte un acousmonium dans son effectif. En 2017, il co-fonde le duo HD, qui réalise des actions allant de la performance à l’événement conceptuel.

En 1995, il prend la responsabilité de la classe de composition du conservatoire de Perpignan où il programme une saison régulière de six concerts par an. À partir de 1997, il organise à l’INA-GRM les Empreintes, série annuelle de conférences de compositeurs, ainsi que L’Atelier destiné à favoriser les échanges entre le GRM et le milieu musical, et il réalise une base de donnée informatisée pour la gestion des œuvres et des documents de l’Acousmathèque. Il quitte le groupe en 2000. 

En 2002, il fonde le premier cours d’été d’interprétation acousmatique à Crest ; celui-ci réunit chaque année une douzaine de stagiaires du monde entier pendant plus d’une semaine. En 2007, il crée et devient le professeur titulaire d’une classe de composition électroacoustique et création sonore au Conservatoire à Rayonnement Régional de Paris. Deux ans plus tard, il est professeur de création musicale en composition électroacoustique au Pôle supérieur d’enseignement artistique Paris Boulogne-Billancourt.

Compositeur depuis 1976, il est l’auteur de nombreuses œuvres instrumentales (orchestrales, de chambre, vocales) et électroacoustiques où il joue, dans la fluidité d’un phrasé baroque, de la mobilité des figures, de l’exploration des morphologies nouvelles (issues du travail du support), des couleurs et des articulations, dans un style aux accents et au lyrisme affirmés. Dans ses dernières œuvres acousmatiques, il réintroduit la voix humaine, ses effets dramatiques et narratifs, dans l’univers très formel de la musique de support dont il fait le lieu d’une nouvelle théâtralité. Denis Dufour fait partie des quelques compositeurs français qui œuvrent avec la même envie dans ces deux univers (instrumental et acousmatique) pour lesquels il crée des œuvres d’une égale maturité stylistique et d’une ferveur rigoureuse et iconoclaste.

Denis Dufour est le défenseur d’un concept de spatialisation interprétée des œuvres sonores sur un acousmonium, ou orchestre de haut-parleurs ; il compose pour ce dispositif de très nombreuses pièces, parmi lesquelles Bocalises, grande suite (1978), Entre dames (1982), Messe à l’usage des vieillards (1987), Les Joueurs de sons (1999), La Nuit du Dibdak (2000), Caravaggio (2000), ou encore Volver (2012).

En 2009, il reçoit le Prix de la meilleure composition électroacoustique, délivré par la Sacem, pour PH 27-80 (2008).

Depuis 2013, il est édité par Maison Ona pour les œuvres instrumentales et mixtes.